火焰卫矛(Euonymus alatus 'compacta')属于卫矛科落叶灌木,因其叶片里火焰红色而具有重要的园艺观赏和经济价值,每株成熟的火焰卫矛每年能生产成百上千粒种子。由于通过鸟类和流水的传播,火焰卫矛在美国非常流行,甚至不可控制,破坏其他植物区系,严重威胁生态平衡。本研究以火焰卫矛为研究对象,优化了植株组织培养再生体系,并在此基础上探索农杆菌介导火焰卫矛遗传转化技术,为利用基因工程技术对火焰卫矛进行遗传改良打下了基础。主要研究结果如下: (1)火焰卫矛植株组培再生体系优化 本研究以火焰卫矛成熟胚培养长出的子叶、下胚轴为外植体进行组织培养及植株再生研究,优化了火焰卫矛组织培养再生体系。研究结果表明:成熟胚培养基为WPM+TDZ0.5mg·L~(-1);愈伤组织诱导培养基为WPM+6-BA6 mg·L~(-1)+IBA0.2 mg·L~(-1);不定芽分化培养基为WPM+6-BA6 mg·L~(-1)+IBA0.2 mg·L~(-1);不定芽增殖和壮苗培养基为WPM+6-BA4 mg·L~(-1);生根培养基为1/2MS+NAA0.2 mg·L~(-1)+AC0.5 g·L~(-1)。移栽基质为营养土,成活率为83.3%。 (2)农杆菌介导火焰卫矛遗传转化体系建立 以火焰卫矛子叶和下胚轴为转化受体进行遗传转化体系研究,确定了子叶和下胚轴不定芽分化的有效卡那霉素(kan)筛选压分别为60 mg·L~(-1)和50 mg·L~(-1);而在抑菌剂头孢霉素(cef)和特美汀(Timentin)浓度对比研究中发现,Timentin对不定芽分化的影响要小于头孢霉素(Cef)的影响,Timentin浓度为400 mg·L~(-1)时,子叶分化率达到23.89%,而Cef在相同浓度下子叶分化率仅为15.56%;并确定Timentin最佳抑菌浓度为200 mg·L~(-1)。探讨了遗传转化过程中外植体预培养时间、共培养时间、浸染菌液浓度和浸染时间对遗传转化效率的影响。结果表明,外植体预培养2 d,共培养3d,菌液浓度OD600为0.4～0.5,浸染6 min为最佳技术参数;在YEP液体培养基中添加100μmol·L~(-1)AS可提高转化率8.8%。 (3)转基因植株筛选鉴定 通过农杆菌介导法遗传转化火焰卫矛,并对转化植株进行GUS组织活性及PCR检测,证明由Barnase和iaaM组成的超级不育表达元件已经整合到火焰卫矛植株,从78株抗性植株中筛选出转基因植株3株。

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